反复种植失败患者Th1、Th2细胞因子在应用低分子肝素后的改变及最
《健康女性》
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邹廉 苗莉霞
无锡市妇幼保健院生殖医学中心 江苏 无锡214002
摘要 目的 探讨反复种植失败（RIF）患者外周血中Th1、Th2细胞比例在应用低分子肝素（LMWH）前后的改变及周期结局变化。 方法 选择2019年5月～2021年12月在我院生殖医学中心做试管婴儿周期助孕的RIF患者100例分为两组，一组为实验组，即黄体转化日起予依诺肝素钠+常规黄体支持，50例；另一组为对照组，即常规黄体支持组，50例。用流式细胞技术分别检测两组患者外周血中Th1、Th2细胞因子水平。 结果 相较于对照组，实验组的Th1相关细胞因子显著降低，TNF-α/IL-4和IFN-γ/IL-10比值降低，有统计学差异。Th2相关细胞因子增加不明显。同时实验组临床妊娠率和种植率均高于对照组，有统计学差异。结论 LMWH对于RIF患者外周血中的Th1有抑制作用，可以改善RIF患者的Th1、Th2比例，并最终提高妊娠率和种植率。
关键词 反复种植失败；RIF；Th1；Th2；低分子肝素
随着辅助生殖技术的广泛应用，每年的试管婴儿助孕周期也逐年增长。相对应的失败的病人的也逐渐累计增多。其中，有部分病人经历3次以上优质胚胎移植或多次移植胚胎数量超过10枚仍未获得临床妊娠者定义为反复种植失败（RIF）。在这样的人群中，免疫因素占到了70%以上[1]。提高这类RIF患者的临床妊娠率是亟待解决的医学难题之一。
Th1、Th2细胞是细胞免疫中的重要调节因子，其中Th1细胞主要是引起细胞免疫和一些身体器官等的炎症反应，它主要分泌干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-2等。而Th2细胞主要参与体液免疫它主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等[2]。
妊娠是由母体的免疫系统所主导，当怀孕时，母体中Th2细胞处于主导地位，形成免疫保护。而RIF人群可见有Th1/Th2失衡，Th1细胞因子分泌过多，导致移植失败。许多不明原因的RIF患者可能与母婴之间的免疫耐受有关，这使得免疫耐受缺乏的理论成为可能。一些学者认为可以纠正这样Th1/Th2失衡引起的免疫异常[3]。本次研究旨在通过检测IFN-γ、TNF-α和IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等的变化，来探讨LMWH治疗植入窗口中的异常细胞免疫RIF人群周期的可能性[4-5]。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选择2019年5月～2021年12月在我院生殖医学中心做试管婴儿周期助孕的RIF患者100例分为两组，一组为实验组，即黄体转化日起予依诺肝素钠+常规黄体支持，50例；另一组为对照组，即常规黄体支持组，50例。所有患者发生过自然流产3次及以上，排除了男女双方染色体核型、自身免疫、内分泌激素异常等因素。两组的年龄、不孕年限、基础内分泌激素和体重因子（BMI）等均无异常。
1.2 仪器和试剂Th1、Th2型细胞因子检测仪器为迈瑞公司的流式细胞仪BriCyte E6,检测试剂来自赛基生物技术有限公司，离心机为EPPENDORF公司的5810。
1.3 实验方法 两组患者均于周期黄体转化日及移植日采集静脉血3mL，静置1h，放入离心机3000转/分离心10分钟后取血清转入PCR管中放入-80℃冰箱保存待测。检测当天将标本解冻后放入迈瑞公司的流式细胞仪BriCyte E6中用流式荧光法检测Th1、Th2型细胞因子水平，所有操作均按试剂说明书严格执行。检测前确保质控在控。
1.4 统计方法 计量的数据用平均值（X）±标准差（S）表示，两组间数据比较用t检验，以P<0.05为有统计学意义。
妊娠判定标准：临床妊娠：移植28天以后经阴道超声检查探及孕囊者；早期流产：妊娠12周内自然妊娠终止；异位妊娠：胚胎着床在子宫腔正常位置以外发育者；未临床妊娠：包括移植后12-14天血HCG＜5mIU/ml及生化妊娠者（实验室检查血HCG≥5mIU/ml而临床B超未监测到孕囊）。
2 结果
2.1 两组病人的年龄等基础指标比较没有统计学差异，如表1所示。
表1实验组和对照组的基本情况分析
| 实验组 （n=50） | 对照组 （n=50） | t值/X2值 | P值 | |
| 年龄（岁） | 33.12±4.38 | 33.46±4.85 | 0.47 | 0.640 |
| 不孕年限（y） | 3.94±2.77 | 3.75±2.53 | 0.46 | 0.649 |
| bFSH（mIU/ml） | 6.82±1.09 | 6.73±1.16 | 0.51 | 0.612 |
| bLH（mIU/ml） | 6.14±2.58 | 6.13±3.02 | 0.02 | 0.982 |
| bE2（pg/ml） | 33.75±10.94 | 33.58±11.62 | 0.10 | 0.924 |
| AMH | 3.31±1.68 | 3.40±1.59 | 0.35 | 0.727 |
| 体质指数BMI | 23.3±2.0 | 23.4±1.9 | 0.33 | 0.745 |
| 取卵次数（次） | 3.50±0.55 | 3.48±0.47 | 0.25 | 0.804 |
| 移植胚胎（个） | 1.62±0.56 | 1.63±0.61 | 0.11 | 0.914 |
| *移植优质胚胎率（%） | 72.95%（89/122） | 73.28%（96/131） | 0.004 | 0.953 |
| 转化日子宫内膜厚度（mm） | 9.56±0.16 | 9.58±0.14 | 0.85 | 0.398 |
2.2 两组外周血Th1型细胞因子和Th2型细胞因子表达情况
实验组血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4数据与对照组比较，两者差异有统计学意义（P<0.05）。实验组较对照组血清IFN-γ水平下降、IL-4水平升高（P<0.05）。如表2所示。
表2两组外周血Th1型细胞因子和Th2型细胞因子表达情况
| 实验组（n=50） | 对照组（n=50） | t值 | P值 | |
| TNF-α | 0.95±0.53 | 1.51±0.47 | -5.59 | 0.000 |
| IFN-γ* | 1.55±0.32 | 2.28±0.95 | -5.15 | 0.000 |
| IL-2* | 0.36±0.21 | 1.95±0.69 | -15.59 | 0.000 |
| IL-4* | 1.18±0.21 | 0.98±0.38 | 3.26 | 0.002 |
| IL-6 | 1.23±0.41 | 2.78±1.75 | -6.10 | 0.000 |
| IL-10 | 3.16±0.33 | 2.44±0.47 | 8.87 | 0.000 |
| IL-2/IL-4 | 0.52±0.43 | 1.89±1.08 | -8.33 | 0.000 |
| IL-2/IL-10 | 0.31±0.17 | 0.97±0.38 | -11.21 | 0.000 |
| TNF-α/IL-4 | 0.81±0.27 | 2.85±0.32 | -34.45 | 0.000 |
| TNF-α/IL-10 | 0.35±0.14 | 0.58±0.50 | -3.13 | 0.002 |
| IFN-γ/IL-4 | 1.31±1.06 | 2.62±2.20 | -3.79 | 0.000 |
| IFN-γ/IL-10 | 0.99±0.35 | 1.41±1.02 | -2.75 | 0.008 |
实验组临床妊娠率、种植率均比对照组高（分别为68% & 36%，45.24%& 25.58%），差异有统计学意义（P＜0.05）；两组的早期流产率、异位妊娠率均无统计学差异（P＞0.05）。如表3所示。
表3 两组妊娠结局比较
| 实验组（n=50） | 对照组（n=50） | X2值 | P值 | |
| 临床妊娠率%* | 68．00%（34/50） | 36.00%（18/50） | 10.26 | 0.001 |
| 种植率%* | 45.24%（38/84） | 25.58%（22/83） | 6.36 | 0.012 |
| 早期流产率% | 11.76%（4/34） | 11.11%（2/18） | 0.15 | 0.944 |
| 异位妊娠率% | 2.94% （1/34） | 5.55% （1/18） | 0.69 | 0.641 |
3 讨论
近几年，临床关于RIF与免疫学因素之间的关系展开大量研究，但多数研究集中于子宫内膜局部或动物实验中，而在种植窗期外周血中免疫细胞的表达差异及相关免疫调控治疗仍缺乏大样本的临床研究资料。RIF总体趋向于Th1型等具有促炎活性的细胞因子水平升高，而Th2型抑炎性细胞因子水平降低。因此选择合适的治疗药物调节免疫系统改善这一免疫机制失衡可能会提高RIF患者的着床率和妊娠率。本研究选取了在胚胎着床过程中具有重要作用的6种Th1、Th2型细胞因子作为研究对象，通过检测A、B两组在“种植窗口期”外周血中的表达差异，进一步证实种植窗口期运用LMWH以纠正RIF患者Th1/Th2向Th1倾斜的免疫失衡，提高子宫内膜容受性建立良好胚胎种植环境进而改善这类患者结局。目前大家都认为Th2细胞因子水平升高导致着床成功，而Th1主导的环境导致着床失败。[6]LMWH是由标准肝素通过酶或化学裂解产生的多聚体分子片段，由12-18个糖单位组成的葡聚氨聚糖，平均分子量4000-5000D，属于ATIII依懒性凝血酶抑制剂，且不通过胎盘屏障，对胎儿不产生导致胎儿畸形的影响，故可运用于RIF患者 [7]。我们的研究发现LMWH治疗后Th1相关细胞因子显著降低，TNF-α/IL-4和IFN-γ/IL-10比值降低，而Th2相关细胞因子增加不明显，其治疗后临床妊娠率提高，提示LMWH可以抑制外周血中的Th1细胞，但不能抑制Th2细胞，对改善临床结局有效。种植窗期使用低分子肝素可改善反复种植失败人群的免疫失衡现象，对细胞免疫异常的该类人群是一种有效的治疗策略。为阐明不明原因RIF发生的相关机制提供依据，并为RIF患者的内膜容受性改善提供参考。另外我们发现在RIF组LMWH治疗周期中妊娠组TNF-α/IL-4和IFN-γ/IL-10比值于治疗前高于非妊娠组治疗前水平，提示Th1/Th2比值较高的RIF患者可能是LMWH治疗的候选者。但是我们研究的样本数较小，只能发现一个趋势，尚需要进一步的大样本研究来确定该比率的临界值作为LMWH治疗的指标，为指导临床用药方案提供更精确的证据。
参考文献
[1]亓敏,曲芸芸.原因不明复发性流产患者Th1/Th2型细胞因子、M-CSF、封闭抗体检查价值分析.中国医药科学,2019,9(17):117-119.
[2]Feyaerts D, Benner M. et al. Human uterine lymphocytes acquire a more experienced and tolerogenic phenotype during pregnancy[J]. Sci Rep, 2017,7(1):2884.
[3]Aiping Zhang, Yanlian Xiong,et al. IL-1βenhances human placenta-derived mesenchymal stromal cells ability to mediate Th1/Th2 and Th1/CD4 + IL-10 + T cell balance and regulates its adhesion, proliferation and migration via PD-L1.Cell Immunol, 2020,352:104113.
[4]Nakagawa K, Kwak-Kim J, Ota K. et al. Immunosuppression with tacrolimus improved reproductive outcome of women with repeated implantation failure and elevated peripheral blood TH1/TH2 cell ratios. Am J Reprod Immunol, 2015,73(4):353-361.
[5]王红宇,李明珠.Th1/Th2型细胞因子与原因不明复发性流产的相关性研究.实用医药杂志,2017,34(3):213-7.
[6]刘克锋,赵杰等.低分子肝素联合黄体酮治疗胚胎移植患者反复种植失败的有效性和安全性的Meta分析.中国药房,2020,31(23):2895-2900.
[7]李英连,彭李珍等.低分子肝素结合主动免疫治疗复发性自然流产的效果及对患者血流动力学的影响.中国当代医药,2019,26(19):161-163.